Projetos de Pesquisa

 

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Sandro Roberto Valentini

Ciências Biológicas

Bioquímica
  • desenvolvimento de teste rápido de detecção de partículas virais de sars-cov-2 enriquecidas por suporte funcionalizado com enzima conversora de angiotensina 2 (eca2) e detecção por meio de fragmento de anticorpo para reconhecimento da espícula viral
  • Atualmente, uma síndrome respiratória aguda (SRAG ou, em inglês, SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome) causada por um novo coronavírus (CoV-2) gerou uma pandemia catastrófica para a qual não existem medicamentos nem testes eficientes o suficiente para detectar a doença em diferentes momentos da infecção. Embora filogeneticamente relacionado a outros SARS-CoVs, o novo coronavírus apresenta mutações na sua espícula aumentando a afinidade pelo seu receptor no hospedeiro, a enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2) humana, o que pode ser responsável pela sua maior capacidade de infecção. Por outro lado, a espícula mutada de SARS-CoV-2 pode levar à produção de anticorpos específicos para sua detecção, sem detecção cruzada com outros vírus da mesma família. Desta forma, o objetivo deste projeto de pesquisa é o de gerar fragmentos variáveis de anticorpos de cadeia única (scFv, single-chain variable fragment) com alta afinidade e especificidade frente ao domínio de ligação ao receptor da espícula do SARS-CoV-2 para aplicação em teste diagnóstico de COVID-19 por meio de ensaios enzimáticos de imunoabsorção. Para isso, uma biblioteca de scFv será clonada a partir do mRNA de células B de pacientes contaminados e será expressa na superfície da levedura (YSD, yeast surface display). A expressão em Saccharomyces cerevisiae será induzida por galactose e as sequências peptídicas de scFv serão expostas na superfície por fusão à subunidade 2 da proteína aglutinina. A sequência peptídica do domínio de ligação ao receptor (RBD) será obtida ligada a biotina e após incubação com as leveduras expressando scFv, a interação entre antígeno-anticorpo será avaliada por citometria de fluxo pela adição de estreptavidina-PE/Cy7. A afinidade dos fragmentos variáveis ao domínio RBD será avaliada pela correlação entre fluorescência e concentração do antígeno. Da mesma forma, sequências de outros SARS-CoV comuns serão testadas para avaliar a especificidade de scFv de maior afinidade. A fim de concentrar as partículas virais para revelação do teste por imunoabsorção, o domínio peptidase (que interage com o domínio RBD) será produzido heterologamente em Escherichia coli e será imobilizado em placa de 96 poços. As amostras de pacientes contaminados com SARS-CoV-2 (controle positivo) e não contaminados (controle negativo) serão adicionadas à placa. Posteriormente, serão adicionados os fragmentos scFv purificados a partir da levedura, contendo uma cauda de seis histidinas em fusão. Também serão adicionados anticorpos antihistidina ligados a peroxidase para revelação do resultado de padronização do diagnóstico para SARS-CoV-2. Com este projeto, portanto, pretende-se estabelecer um teste diagnóstico rápido e específico de COVID-19 por meio da identificação da partícula viral a partir de amostra sanguínea, sem necessitar de reagentes e equipamentos de alto custo e que permita o diagnóstico em estágios da doença em que o vírus está ausente das vias aéreas superiores. Este projeto também lança a base para produção de um teste point-of-care em um cartucho cromatográfico, que segue o mesmo fundamento do ensaio enzimático de imunoabsorção. O estabelecimento da plataforma de yeast surface display para fragmentos variáveis contra o domínio RBD permite também a evolução dirigida das sequências variáveis viabilizando rápida detecção de novas interações em um possível novo surto do vírus mutado. Esta plataforma também possibilita a detecção de fragmentos variáveis para outros virus patogênicos, como os virus da dengue, zika e chicungunha. A equipe do laboratório de Biologia Celular e Molecular de Micro-organismos, supervisionado pelo Prof. Dr. Sandro R. Valentini (coordenador deste projeto) e Prof. Dr. Cleslei F. Zanelli é extremamente capacitada na execução dos experimentos e análises de clonagem e expressão de DNA recombinante em bactéria e levedura, purificação de proteínas recombinantes, genética de levedura e citometria de fluxo o que pode ser verificado pelo currículo Lattes dos professores, viabilizando o desenvolvimento do projeto.
  • Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - SP - Brasil
  • 24/07/2020-23/08/2022