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Stenio Perdigão Fragoso

Ciências Biológicas

Bioquímica
  • avaliação do transcritoma do trypanosoma cruzi durante o processo de infecção
  • A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença incapacitante e debilitante que produz perdas sociais importantes nas áreas endêmicas (Américas do Norte, Central e do Sul), em termos de morbimortalidade, absenteísmo, incapacidade laboral e custos médicos-sociais. Estima-se que 8 milhões de pessoas estejam infectadas com T. cruzi e 25 milhões de estejam expostas ao risco de infecção. São reportadas mais de 10.000 mortes a cada ano em decorrência desta moléstia. Ainda não existem vacinas e a quimioterapia é bastante limitada. A doença pode ser dividida em fases aguda e crônica, na qual o dano tissular pode ser direta ou indiretamente induzido pelo parasita. As principais manifestações da fase aguda associam-se a meningoencefalite e miocardite aguda e acontecem em menos de 5% dos infectados; na fase crônica, que é sintomática em cerca de 30% dos pacientes, os principais distúrbios identificados são progressivos e irreversíveis acometendo órgãos como o coração, esôfago e intestinos, causando respectivamente cardiopatia chagásica, megaesôfago e megacólon. O protozoário T. cruzi pode ser transmitido de forma natural ao hospedeiro mamífero através da forma tripomastigota metacíclica presente nas excretas do inseto vetor infectado e posterior contato com mucosas e soluções de descontinuidade da pele. Além da forma natural de infecção, outras formas também têm contribuído para a infecção pelo T. cruzi, como a transfusão de sangue, transplante de órgãos e ingestão de alimentos contaminados com o parasita, este último sendo, hoje, um dos modos mais frequentes de transmissão em algumas regiões do Brasil. O processo de interação deste protozoário com a célula de mamífero compreende desde o contato físico inicial entre as formas infectivas do parasita e a célula hospedeira, passando pela adesão seguida de invasão celular, até os eventos posteriores de diferenciação do parasita para a forma replicativa intracelular, a amastigota, e novamente de transformação em tripomastigota, a forma que será liberada pela lise da célula hospedeira. Esta interação envolve uma série de alterações na expressão gênica tanto da célula hospedeira quanto do T. cruzi, levando a alterações na fisiologia e estrutura tanto da célula alvo como do parasita. Os primeiros estudos em larga escala, baseados na tecnologia de microarranjos, centrados nas alterações dos níveis transcricionais da célula hospedeira frente à infecção por T. cruzi, foram realizados por alguns grupos, inclusive o nosso (modelo T. cruzi Dm28c-cardiomiócito), que detectaram modulação na expressão de genes relacionados à resposta imune, ao citoesqueleto e ao ciclo celular, entre outros. Desde a última década, os estudos para avaliar o transcritoma celular vêm sendo realizados através da tecnologia de RNA-seq, que tem uma sensibilidade bem maior que a dos microarranjos, além de ser altamente quantitativa, permitindo, teoricamente, a identificação de todos os transcritos de um sistema celular, incluindo aqueles pouco representados, como os de um parasita contido dentro de uma célula de mamífero. Para expandir o conhecimento acerca do processo de infecção celular pelo T. cruzi, iniciamos o estudo da interação entre dois clones de T. cruzi – Dm28c e CL Brener (ambos com extensa literatura associada a sua utilização por diversos grupos de pesquisa em experimentos de diferenciação, infecção, interação parasita-hospedeiro, etc.) – e duas linhagens celulares, células HeLa e H9c2 – câncer cervical humano e mioblasto cardíaco de rato, respectivamente, visando avaliar o perfil de expressão gênica tanto da célula hospedeira quanto do parasita através da tecnologia de sequenciamento em larga escala. As infecções foram realizadas e o RNA total foi extraído e sequenciado através de RNA-seq. Estamos agora processando as informações relativas ao transcriptoma das células hospedeiras. Entretanto, embora tenham sido detectadas leituras correspondentes aos RNAs do T. cruzi, a cobertura foi insuficiente para a análise do transcriptoma do parasita durante o processo de infecção. O objetivo da presente proposta é dar continuidade à avaliação do transcriptoma do T. cruzi, agora usando um protocolo descrito recentemente pelo nosso grupo, onde o RNA do parasita é amplificado in vitro a partir do RNA total extraído das células infectadas como uma etapa prévia ao RNA-seq, permitindo obter leituras mais consistentes. O estudo da infecção por T. cruzi utilizando vários tipos celulares, como também várias cepas do parasita, permitirá a identificação de processos comuns e idiossincráticos de cada interação.
  • Fundação Oswaldo Cruz - RJ - Brasil
  • 05/12/2019-31/12/2021