Projetos de Pesquisa

 

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Alejandro Correa Dominguez

Ciências Biológicas

Biotecnologia
  • prospectando o potencial terapêutico das vesículas extracelulares obtidas de células-tronco mesenquimais derivadas de células-tronco pluripotentes humanas
  • Células-tronco mesenquimais (CTM) são células-tronco adultas indiferenciadas com capacidade de autorrenovação e diferenciação celular presentes na medula óssea e em vários, provavelmente em todos, os órgãos e tecidos. O grande interesse das CTM na medicina regenerativa reside na habilidade que essas células apresentam para manter a homeostase tecidual e induzir reparos no tecido danificado. O uso de CTM para a terapia celular advém da hipótese de que essas células são capazes de diferenciar em células especializadas dentro do tecido lesionado. No entanto, sabe-se agora que apenas uma pequena fração das células transplantadas se integra e sobrevive no tecido lesionado. Portanto, o mecanismo predominante através do qual as CTM participam no reparo do tecido está relacionado com sua atividade parácrina. De fato, as CTM fornecem ao microambiente uma quantidade de sinais tróficos e de sobrevivência, incluindo fatores de crescimento e citocinas. Essas células também são capazes de regular a resposta imune e contribuir para o processo reparador em diferentes condições patológicas. Recentes descobertas sugerem que as Vesículas extracelulares (VE, incluindo microvesículas e exossomos) liberadas pelas CTM são importantes para a manutenção das funções fisiológica dessas células. Por transferir proteínas, lipídeos e várias formas de RNA às células vizinhas, acredita-se que o papel principal das VE é mediar diversas respostas biológicas. Dentre elas estão das propriedades de reparação/proteção do tecido lesionado e de modulação do sistema imune. Portanto, as VE derivadas das CTM representam uma oportunidade inédita de utilização em terapias regenerativas livre de células. Porém, pelo menos duas limitantes importantes se contrapõem às vantagens dessa aproximação terapêutica. A primeira se refere à produção padronizada e em grande escala das CTM, o qual constitui um desafio devido ao tempo de vida finito (limitada capacidade de proliferação/autorrenovação) destas células. Segundo, e igualmente importante, é a grande variação entre doadores e os tecidos de origem. Essas limitações poderiam ser contornadas se contássemos com uma fonte única e inesgotável de CTM tais como células-tronco pluripotentes e, como consequência, das VE derivadas destas. Assim, propomos utilizar CTM derivadas a partir de células-tronco humanas pluripotentes (embrionárias ou induzidas). A derivação será realizada seguindo protocolos descritos na literatura, desde protocolos simples de derivação espontânea até protocolos que utilizam fatores de crescimento específicos. As células-tronco mesenquimais derivadas de célula pluripotentes (CTM-CP) serão avaliadas no referente a: (i) a expressão / ausência de marcadores associados com a CTM derivadas de tecido adulto (CD146+, CD105+, CD73+, CD90+, SRO-1+. MHCI+, MHCII-, CD45-, CD34-); (ii) a multi-potencialidade para se diferenciar em adipócitos e células tipo osteócito; (iii) características morfológicas e adesão ao plástico; (iv) estabilidade cromossômica; (v) ausência de marcadores pluripotentes e capacidade “teratogênica” in vitro. Uma análise prospectiva da utilização de VE derivadas de CTM produzidas a partir de células pluripotentes (CTM-CP) exige em primeiro lugar uma caracterização exaustiva deste recurso para estabelecer a equivalência ou desvio destas CTM-CP com as CTM derivadas de tecido utilizando os protocolos tradicionais. Para tanto, nesse trabalho pretende-se: A - Comparar CTM derivadas de medula óssea humana e CTM-CP utilizando o RNA associado aos polissomos e os microRNAs. A utilização da fração polissomal permitirá estabelecer um perfil de expressão mais fidedigno e próximo ao proteoma celular; B - isolar VE de CTM humanas e de CTM derivadas de células-tronco pluripotentes humanas, assim como caracterizar em profundidade do ponto de vista celular e molecular (ácidos nucleicos e proteínas) essas VE. Devemos destacar que com esses dados a disposição poderemos analisar de forma comparativa e prospectiva a utilização de VE derivadas de CTM-CP visando o melhoramento da função e o desenho de estudos in vitro e, possivelmente, pré-clínicos com modelos de doenças variados. Seguindo essas caracterizações fundamentais, um objetivo em longo prazo seria a de editar geneticamente biomoléculas específicas (i.e. produtos genes bio-terapêuticos ou “hairpin” curto de um RNA de interferência especifico) para realizar a entrega dessas biomoléculas através de VE seja em arranjos de moléculas simples ou complexas.
  • Fundação Oswaldo Cruz - PR - Brasil
  • 05/12/2019-31/12/2021
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Alejandro Ferraz do Prado

Ciências Biológicas

Biotecnologia
  • uso de mmp-2 recombinante para avaliar os mecanismos intracelulares envolvidos na disfunção cardíaca e vascular induzidos pelo aumento plasmático de mmp-2
  • A metaloproteinase da matriz (MMP)-2 é uma das mais estudadas MMPs envolvidas no remodelamento cardiovascular em doenças como insuficiência cardíaca e hipertensão. Estudos mostraram que o aumento de MMP-2 no coração pode induzir disfunção cardíaca. No entanto, esses mecanismos ainda não estão totalmente elucidados. Estudo recente mostra que a MMP-2 ativa vias pró-oxidantes que resultam em disfunção vascular. Deste modo, a hipótese deste estudo é que a disfunção cardiovascular é decorrente do aumento do estresse oxidativo. Para avaliar a nossa hipótese nos iremos realizar dois estudos, primeiramente um “time-course” avaliando os efeitos cardiovasculares induzidos pela MMP-2 durante 1-4 semanas. Em seguida, iremos avaliar se os antioxidantes (tempol e N-acetilcisteína) e a doxiciclina impedem a disfunção cardiovascular induzida pelo aumento plasmático de MMP-2. Para realização deste trabalho iremos expressar a MMP-2 de bactéria E.coli e a proteína será purificada em coluna cromatográfica de gelatina sefarose. Para o tratamento in vivo serão utilizados camundongos C57BL/6 [Wild type (Wt)]. Os animais Wt serão tratados com MMP-2 (150 ng/g de peso corporal) durante 1-4 semanas a partir da 7º semana. Como controle experimental, animais serão tratados com salina (NaCl 0,9%) ou com MMP-2 sem atividade (MMP-2 mutada) via intraperitoneal. Para avaliar os efeitos dos antioxidantes (Tempol e N-acetilcisteína) e doxiciclina os animais serão tratados com MMP-2 (150 ng/g de animal) durante 4 semanas na ausência e presença das drogas. Ao final de todos os tratamentos, será coletado o sangue, coração e aorta. O sangue será utilizado para realização de hemograma e dosagens séricas de colesterol total e frações, TGO, TGP, glicemia, dosagem e atividade de MMP-2. Metade dos corações e aortas coletadas serão fixadas para histologia (HE, orceína e picrosirius). Outra metade será para análise de atividade de MMPs, imunofluorescência, PCR em tempo real, espécies reativas, atividade antioxidante, western blotting e zimograma.
  • Universidade Federal do Pará - PA - Brasil
  • 18/02/2019-28/02/2022