Projetos de Pesquisa

 

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Alexandre Dias Tavares Costa

Ciências Biológicas

Biotecnologia
  • validação de uma solução tecnológica completa (extração de dna + qpcr) para auxílio no diagnóstico de plasmodium falciparum ou plasmodium vivax em ambientes com pouca infraestrutura
  • A Região de Porto Velho está localizada na região amazônica, com temperatura média ao redor de 30 oC durante todo o ano, alcançando frequentemente os 40 oC, e humidade média de 50% nos meses secos, junho-outubro, e 90% nos meses de chuva, entre novembro e maio. Dados recentes apontam que certa de 77 mil pessoas vivem em 82 assentamentos próximos a Porto Velho, tanto em Rondônia como no sul do Amazonas. Entre os estados de Rondônia e Amazonas, estabelece-se uma situação conhecida como malária de fronteira, com desorganização social e com aumento de risco para adultos e crianças vivendo próximo às matas. Nestas regiões, o acesso a serviços básicos de saúde é grandemente afetado, sendo necessários deslocamentos de várias horas para obtenção deste serviço público. Essa dificuldade de acesso resulta em atraso do diagnóstico e tratamento dos casos, predispondo a região a surtos e manutenção da infecção localmente. Para estas populações, o acesso a métodos de diagnósticos confiáveis é de fundamental importância. A microscopia ótica (MO) sempre foi o método de escolha para uso em áreas de difícil acesso ou com baixa infraestrutura. MO é útil por usar apenas um microscópio simples, mas tem a desvantagem de necessitar de um técnico bem treinado que será capaz de detectar apenas concentrações de até 100 parasitas/µL de sangue. Entretanto, MO usualmente não é útil no diagnóstico de pacientes assintomáticos, ou com baixa parasitemia, que podem funcionar como reservatórios de parasitas, sendo esta identificação crucial para que sejam atingidos os objetivos propostos pela OMS para eliminação da malária. Testes de cromatografia de fluxo lateral (ou testes rápidos) são testes sorológicos capazes de detectar antígenos específicos de cada parasita em baixo volume de amostra, em apenas 15 minutos e sem uso de equipamentos ou energia elétrica. Entretanto, o uso destes testes tem diminuído devido a geração de resultados falso-positivos, problemas técnicos decorrentes de condições ambientais como alta umidade e/ou temperatura, além da baixa sensibilidade (70-75% no campo) apesar de valores maiores reportados para testes em laboratório. Testes baseados na detecção de ácidos nucleicos (NAT) são mais sensíveis e específicos, sendo capazes de detectar os níveis de infecção encontrados em pacientes assintomáticos. Dentre os testes disponíveis, PCR em Tempo Real (qPCR) é o mais usado em laboratórios de referência e testes comerciais, embora outros métodos tenham sido desenvolvidos e também estejam disponíveis para diagnóstico de malária. Em desenvolvimentos recentes, técnicas de fluxo lateral foram combinadas com amplificação de ácidos nucleicos para detecção de doenças infecciosas em ambientes com pouca infraestrutura. Entretanto, testes NAT necessitam de preparação de amostra trabalhosa e equipamentos sensíveis, o que impede que sejam usados em situações de campo. Para mitigar a situação, diversos protocolos de armazenamento e preparação de amostras usando procedimentos simplificados têm sido propostos, geralmente acoplados a equipamentos portáteis para execução do teste NAT. Nos últimos anos, nosso grupo trabalhou para desenvolver e validar um teste NAT baseado em qPCR para auxílio no diagnóstico de malária, composto por reagentes produzidos no Brasil, tanto para uso em laboratórios quanto para uso em um equipamento portátil, o Q3-Plus. O Q3-Plus é um equipamento leve e portátil (aprox. 300 gramas) que executa reações de qPCR num chip de silício e transmite os resultados para um software que grava e analisa automaticamente os dados. Entretanto, como os reagentes da qPCR são termolábeis, usamos a tecnologia da gelificação para armazenar os reagentes já no local de reação (placa ou chip). A gelificação é uma técnica que mistura agentes estabilizantes e termo-protetores à solução de qPCR que, quando submetida a vácuo, forma uma estrutura em gel que permite que os reagentes sejam armazenados em refrigerador ou temperatura ambiente (20-25 oC). A técnica já foi usada para gelificar reagentes de qPCR para detecção de Campilobacter, T. cruzi, e também malária. Recentemente, nosso grupo otimizou e validou uma qPCR para detecção do DNA de P. falciparum ou P. vivax em amostras de sangue, desenvolvida com reagentes nacionais, que havia sido gelificada na placa do equipamento e armazenada em temperatura ambiente por até 2 meses. Em paralelo, otimizamos um protocolo para extrair DNA dos parasitos a partir de amostras de sangue armazenadas em papel de filtro tipo FTA Micro Elute. Os papéis FTA Micro Elute possuem agentes caotrópicos e solubilizantes embebidos nas suas fibras, os quais se misturam com a solução que é aliquotada, resultando na lise das células e liberação do conteúdo intracelular. Nestas condições, proteínas se ligarão fortemente às fibras do papel, enquanto o DNA poderá ser eluído para solução com facilidade. Este protocolo foi validado com >100 amostras e se mostrou tão eficiente quanto um kit de extração de DNA comercial. Pretendemos aliar o protocolo rápido de extração de DNA a partir de papel de filtro com a portabilidade do equipamento Q3-Plus e a praticidade das reações de qPCR ‘prontas para uso’ para compor uma solução tecnológica completa, capaz de detectar o DNA do parasito causador da malária em áreas remotas e sem infraestrutura, como assentamentos e garimpos na região amazônica. Configurado como um kit, a solução tecnológica proposta engloba todos os passos necessários para a realização de um teste de base molecular em campo, permitindo que agentes de saúde iniciem eventuais tratamentos, mesmo em pacientes persistentemente assintomáticos, sem necessidade da população se deslocar a um ambulatório de diagnóstico de malária no centro urbano mais próximo, geralmente a algumas horas de distância.
  • Fundação Oswaldo Cruz - PR - Brasil
  • 07/01/2020-31/01/2023
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Alexandre Fernandes Perazzo

Ciências Agrárias

Zootecnia
  • prospecção, isolamento, identificação e caracterização de bactérias lácticas e seu uso como inoculante na ensilagem de milheto
  • O objetivo da presente proposta é efetuar a prospecção, o isolamento, identificação e caracterização de bactérias lácticas e seu uso como inoculante na ensilagem do milheto. Inicialmente será efetuada a ensilagem do milheto onde serão isoladas colônias de culturas láticas da planta e da silagem em períodos de fermentação: 3, 10, 30, 60 e 120 dias. Nesses mesmos períodos serão quantificadas as populações de bactérias láticas, mofos e leveduras e enterobactérias, bem como avaliados o perfil fermentativo das silagens. Após isoladas e purificadas as colônias, serão efetuados tetes de coloração de gram, reação à catalase, crescimento em diferentes temperaturas, concentrações de sais e pH. Também será monitorada a atividade antagonistas dos isolados. Os isolados serão identificados por meio da extração e amplificação do DNA pela técnica de PCR. As sequências obtidas de cada isolado serão comparadas com aquelas disponíveis no banco de dados do GenBank, e alinhadas usando o algoritmo BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) para nucleotídeos. As sequências do gene rRNA 16S que apresentaram similaridade igual ou maior que 97% serão consideradas como pertencentes a uma mesma Unidade Taxonômica Operacional (UTO). No segundo momento, os isolados pré-selecionados serão utilizados em um experimento com o objetivo de avaliar o efeito de inoculantes isolados durante a ensilagem sobre o perfil fermentativo, populações microbianas, perdas, estabilidade aeróbia e composição química da silagem do milheto. O delineamento experimental será inteiramente casualizado, arranjado em esquema fatorial 5 × 5, sendo 5 tratamentos e 5 períodos de abertura (3, 7, 15, 45 e 90 dias após ensilagem), com 5 repetições. Dos tratamentos, três serão as estirpes de bactérias lácticas isoladas do experimento 1, com base na atividade antimicrobiana e no resultado dos testes bioquímicos. Dessa forma os tratamentos serão: Controle – sem inoculante; Bactéria láctica homofermentativa; Bactéria lática heterofermentativa; Mix de bactéria lática homofermentativa e bactéria lática heterofermentativa; e um inoculante comercial para silagem de milho. Espera-se com a execução dessa pesquisa compreender o processo de ensilagem do milheto e revelar culturas lácticas com potencial para serem usadas como inoculante.
  • Universidade Federal da Paraíba - PB - Brasil
  • 18/02/2019-31/08/2022